Doctoral thesis

Regulation of vascular endothelial function by RhoA/Rho-kinase pathway : implications for cardiovascular diseases

    11.05.2005

137 p.

Thèse de doctorat: Université de Fribourg, 2005

English German The vascular endothelium plays an important role in the maintenance of normal cardiovascular functions. It prevents smooth muscle contraction, inhibits smooth muscle cell proliferation and/or migration and exerts anti-thrombotic effects. One of the most important factors derived from endothelial cells is nitric oxide (NO) which is produced via activation of endothelial NO synthase (eNOS). eNOS metabolizes the substrate L–arginine to NO in the presence of co-factors under physiological conditions. However, under disease conditions, such as atherosclerosis, diabetes, hypertension, aging, etc., NO bioavailability is decreased, which is implicated in initiation and evolution of the disease process. The decreased NO bioavailability is either attributed to a decreased eNOS gene expression or decrease in enzyme activity or inactivation of bioactive NO by oxidative stress. RhoGTPase is a member of the Ras superfamily of small GTP-binding proteins which is not only involved in regulation of cellular functions associated with cytoskeleton reorganisation such as platelet aggregation, smooth muscle contraction and cell migration, but also in regulation of gene expression. Studies in recent years demonstrate that RhoA suppresses eNOS gene expression in endothelial cells by destabilizing eNOS mRNA. Inhibition of RhoA by the HMG-CoA reductase inhibitors or statins upregulates eNOS expression. These may importantly contribute to the beneficial effects of the drugs in patients with coronary heart diseases. In the first part of the project we further confirmed the role of the RhoGTPase, RhoA in down-regulation of eNOS gene expression in human endothelial cells. This effect is mediated by down-stream effector Rho-kinase (ROCK). Most importantly, we established a role of RhoA/ROCK pathway in inhibition of Akt/eNOS cascade, i.e. activation of RhoA/ROCK inhibits PKB/Akt activity and subsequently activation or phosphorylation of eNOS at S-1177. In the second part of the project we explored another important role of Rho/ROCK pathway in regulation of eNOS activity namely stimulation of arginase in endothelial cells. Arginase competes with eNOS for the substrate L-arginine. It metabolizes L-arginine to urea, thus depletes intracellular L-arginine for NO production. We showed that overexpression of RhoA or ROCK active mutants enhances arginase activity in endothelial cells. Interestingly, in ApoEP -/- P atherosclerotic mice aorta, RhoA expression was much more pronounced as compared to the wild type animals, which is correlated with a higher arginase activity in ApoEP -/- P mice aortas. In atherosclerotic ApoEP -/- P mice aortas, L-arginine caused a more pronounced contraction as compared to wild type mice. This response was reversed to a greater relaxation by an arginase inhibitor L-norvaline in ApoEP -/- Pmice compared to the wild type animals. The results demonstrate that an increased arginase activity mediated by Rho/ROCK pathway is involved atherosclerotic endothelial dysfunction. In the third part of the project, we demonstrated that Rho/ROCK pathway together with p38P mapk P increases expression of endothelial tissue factor which is critical in thrombus formation and acute coronary syndromes. In this part of the project, we showed that high density lipoprotein (HDL) on one hand activates PI3K/Akt/eNOS pathway and on the other hand inhibits tissue factor expression. The inhibition of endothelial tissue factor expression by HDL is mediated through inhibition of RhoA and activation of PI3K, independent of the downstream enzymes, Akt/eNOS. Taken together, our results demonstrate multi-functional roles of Rho/ROCK pathway in endothelial dysfunction, which may be importantly involved in the pathogenesis of cardiovascular disease. Das Gefässendothel spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung normaler kardiovaskulärer Funktionen. Es verhindert die Kontraktion glatter Muskulatur, hemmt die Proliferation und/oder Migration der glatten Muskelzellen und übt eine antithrombotische Wirkung aus. Einer der wichtigsten Faktoren endothelialer Herkunft ist Stickstoffmonooxid (NO), das durch Aktivierung der endothelialen NO-Synthase (eNOS) produziert wird. eNOS setzt als Substrat L-Arginin unter physiologischen Bedingungen und in Anwesenheit von Cofaktoren zu NO um. Im Verlauf bestimmter Krankheiten, z.B. bei Arteriosklerose, Diabetes und Bluthochdruck, oder im Alter ist die biologische Verfügbarkeit von NO jedoch verringert, was mit der Entstehung und dem Fortschreiten dieser Prozesse in Verbindung gebracht wird. Diese verringerte biologische Verfügbarkeit von NO wird entweder auf eine geringere eNOSExpression oder einen Rückgang der Enzymaktivität bzw. eine Inaktivierung von aktivem NO durch oxidativen Stress zurückgeführt. Die RhoGTPase ist ein Mitglied der Ras-Superfamilie kleiner GTP-bindender Proteine. Sie ist nicht nur an der Regulation mit Cytoskelettreorganisation verbundener zellulärer Prozesse wie Blutplättchenaggregation, Kontraktion glatter Muskulatur und Zellmigration, sondern auch an den Regulation der Genexpression beteiligt. In den letzten Jahren haben Studien ergeben, dass RhoA eNOS-Expression in endothelialen Zellen durch Destabilisierung der eNOS-mRNA unterdrückt. Hemmung von RhoA durch HMG-CoAReduktaseinhibitoren oder Statine erhöht eNOS-Expression. Dies kann zu den positiven Effekten der Medikation bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit beitragen. Im ersten Teil des Projekts haben wir die Rolle der RhoGTPase RhoA bei der Herunterregulierung der eNOS-Expression in menschlichen Endothelzellen bestätigt. Diese Wirkung wird durch den Effektor Rho-Kinase (ROCK) vermittelt. Insbesondere haben wir eine Beteiligung des RhoA/ROCK-Signalwegs an der Hemmung der Akt/eNOS-Kaskade nachgewiesen, d.h., die Aktivierung von RhoA/ROCK hemmt PKB/Akt-Aktivität und verhindert infolgedessen Aktivierung oder Phosphorylierung von eNOS an S-1177. Im zweiten Teil des Projekts haben wir eine weitere wichtige Funktion des RhoA/ROCK-Signalwegs in der Regulation der eNOS-Aktivität, die Stimulation des Enzyms Arginase in Endothelzellen, untersucht. Die Arginase setzt L-Arginin zu Harnstoff um, wodurch intrazelluläres L-Arginin, das für die NO-Bildung eingesetzt wird, abgezogen wird. Wir konnten zeigen, dass die Ueberexpression aktiver Formen von RhoA oder ROCK die Arginaseaktivität in Endothelzellen erhöht. Interessanterweise war die RhoA-Expression in den Aortae arteriosklerotischer ApoEP -/- P- Mäuse deutlich höher als in denen der Wildtyp- Mäusen. Dies korrelierte mit einer erhöhten Arginaseaktivität in den ApoE-/- Mäusen. In den Aortae der arteriosklerotischen Mäuse rief L-Arginin eine stärkere Kontraktion als in denen der Wildtyp-Mäuse hervor. Diese Reaktion wurde bei Behandlung mit dem Arginaseinhibitor L-Norvalin in eine stärkere Relaxation der ApoEP -/- P-Aortae gegenüber den Wildtypgefässen umgekehrt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die durch den RhoA/ROCK-Signalweg erhöhte Arginaseaktivität an arteriosklerotischer Fehlfunktion des Endothels beteiligt ist. Im dritten Teil des Projekts konnten wir nachweisen, dass der RhoA/ROCKSignalweg zusammen mit p38P mapk P die Expression des endothelialen Tissue-Faktors erhöht. Tissue-Faktor ist kritisch für die Gerrinselbildung und spielt eine wichtige Rollen bei akuten koronaren Symptomen. In diesem Teil des Projekts zeigten unsere Resultate, dass das High- Density-Lipoprotein (HDL) einerseits den PI3K/Akt/eNOS-Signalweg aktiviert und andererseits die Expression des Tissue-Faktors hemmt. Die Hemmung der Expression des endothelialen Tissue-Faktors durch HDL ist auf zwei Mechanismen zurückzuführen: Hemmung von RhoA und Aktivierung der PI3K, wobei die weiter abwärts im PI3KSignalweg liegenden Enzyme Akt und eNOS nicht involviert sind.
Faculty
Faculté des sciences
Department
Département de Médecine
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  • English
Classification
Medicine
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