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Texte intégral
Doctoral thesis

Regulation of tissue factor expression : implications for coronary artery disease

    07.11.2006

105 p

Thèse de doctorat: Université de Fribourg, 2006

English German The innermost layer of a vessel, the endothelium, forms an interface between the circulating blood in the vascular lumen and the vessel wall. The endothelium functions as a.) a physical barrier between the blood and the vessel; b.) a vital source of enzymes activating and deactivating cardiovascular hormones; c.) a site of production of relaxing and contracting factors; and d.) a source of growth inhibitors and promoters. Risk factors such as diabetes, hypertension, obesity and smoking can disturb the integrity of the endothelium rendering it dysfunctional. A dysfunctional endothelium is characterized by a decreased endotheliumdependent relaxation which in turn facilitates the entry and oxidation of circulating lipoproteins and monocytes through the endothelium into the intima. The advancing accumulation of lipoproteins and monocytes into the intima eventually gives rise to an early atherosclerotic lesion which later develops into a necrotic core and a fibrous cap and ultimately becomes an advanced plaque at risk of rupture. Rupture of unstable plaques is responsible for coronary thrombosis, the main cause of unstable angina, acute myocardial infarction, and sudden cardiac death. Percutaneous transluminal coronary angioplasty is a clinical procedure routinely employed to revascularise occluded vessels. Following percutaneous transluminal coronary angioplasty a tube-like metal structure, a stent, is inserted into the vessel to prevent it from occluding once again. Stents are commonly coated with drugs orientated at inhibiting the excessive proliferation of vascular smooth muscle responsible for restenosis. Unlike for restenosis, recent evidence has shown that the incidence of in stent thrombosis has not decreased following the advent of drug eluting stents. Rapamycin which is widely used for coating stents has been shown to induce the expression of TF, the key initiator of the coagulation cascade. This finding shed new light on the possible causes for the occurrence of stent thrombosis. In the first part of this thesis we characterised the impact of paclitaxel, the main alternative to rapamycin, on TF expression in human endothelial cells. Indeed, paclitaxel enhanced thrombin-induced endothelial TF protein expression in a concentration- and time-dependent manner. A concentration of 10-5 mol/L elicited a 2.1-fold increase in TF protein and a 1.6-fold increase in cell surface TF activity. The effect was similar after a 1 h as compared to a 25 h pretreatment period. Real-time polymerase chain reaction revealed that paclitaxel increased thrombin-induced TF mRNA expression. Paclitaxel potently activated c-Jun terminal NH2 kinase (JNK) as compared to thrombin alone, while the thrombin-mediated phosphorylation of p38 and extracellular signal-regulated kinase remained unaffected. Similar to paclitaxel, docetaxel enhanced both TF expression and JNK activation as compared to thrombin alone. The JNK inhibitor SP600125 reduced thrombin-induced TF expression by 35%. Moreover, SP600125 blunted the effect of paclitaxel and docetaxel on thrombin-induced TF expression. Paclitaxel increases endothelial TF expression via selective activation of JNK. This observation provides novel insights into the pathogenesis of thrombus formation after paclitaxel-eluting stent deployment and may have an impact on drug-eluting stent design. In the second part of this thesis we directed our efforts at characterising the potential application of Dimethyl sulfoxide (DMSO) as a novel agent to be used for stent coating. DMSO is used for preservation of hematopoietic progenitor cells and infused into patients undergoing bone marrow transplantation. Despite of its intravenous application, the impact of DMSO on vascular cells has not been assessed. In this study we found that DMSO inhibited TF expression in human endothelial cells, monocytes, and VSMC. Real-time PCR revealed that inhibition of TF expression occurred at the mRNA level. This effect was mediated by reduced activation of the MAP kinases JNK and p38, but not ERK. In vivo, DMSO treatment suppressed TF activity and prevented thrombotic occlusion in a mouse model of carotid artery photochemical injury. DMSO also inhibited VSMC proliferation and migration in a concentration-dependent manner; moreover, it prevented rapamycin and paclitaxel-induced upregulation of TF expression. As the use of DMSO is established in different areas of modern medicine, we propose this drug as a novel strategy for treating acute coronary syndromes; in particular, DMSO seems to represent an attractive compound for application on drug-eluting stents, either alone or in combination with rapamycin or paclitaxel. Das Endothel als innerste Schicht eines Blutgefässes stellt eine Verbindung zwischen dem Blutstrom und dem Rest der Gefässwand dar. Es fungiert als eine physikalische Barriere zwischen Blut und Gefäss, dient als Quelle für Wachstumsfaktoren –und Inhibitoren sowie für Enzyme, die kardiovaskuläre Hormone sowohl aktivieren als auch deaktivieren, und ist an der Produktion von Kontraktions- bzw. Relaxations-Faktoren beteiligt. Risikofaktoren wie Daibetes, Hypertonie, Adipositas und Rauchen stören die Integrität des Endothels und führen zum Verlust der Funktionalität. Eine endotheliale Dysfunktion wird durch eine reduzierte NO Synthese gekennzeichnet, was wiederum die Aufnahme und Oxidierung zirkulierender Lipoproteine und Monozyten durch das Endothel in die Intima erleichtert. Diese vortschreitende prozess führt möglicherweise zu einer frühen arteriosklerotischen Läsion, welche sich mit der Zeit zu einer plaque mit nekrotischem Kern und fibroider Schale entwickelt, woraus im weiteren Verlauf eine plaque mit Gefahr der Ruptur entstehen kann. Die Ruptur einer instabilen Plaque ist verantwortlich für koronare Thromben, die Hauptursachen für ein akutes coronares Syndrom. Perkutane transluminale koronare Angioplastie ist ein in der Klinik routinemässig eingesetztes Verfahren zur Revaskularisierung verschlossener Gefässe. Daran angeschlossen ist die Einlage einer als Stent bezeichneten röhrenförmigen Struktur, was das wiedereröffnete Gefäss vor erneutem Verschluss bewahren soll. Stents sind gewöhnlich mit Substanzen beschichtet, welche die für eine Restenose ursächliche excessive Proliferation glatter Gefässmuskulatur unterbindet. Wie neulich gezeigt werden konnte ist, im Gegensatz zu Restenose, die Inzidenz für In-Stent-Thrombosen durch die Anwendung von sogenannten „Drug eluting stents“ nicht gesunken. Es konnte nachgewiesen werden, dass das vielfach zur Beschichtung von Stents verwendete Rapamycin die Expression von TF, Hauptinitiator der Koagulationskaskade, induziert, was ein neues Licht auf mögliche Ursachen für das Auftreten von In-Stent- Thrombosen wirft. Im ersten teil dieser Arbeit charakterisieren wir die Auswirkungen des als alternativ zu Rapamycin vorwiegend verwendeten Paclitaxel auf die TFExpresssion in menschlichen Endothelzellen. In der Tat steigert Paclitaxel die durch Thrombin induzierte endotheliale TF Protein Expression sowohl konzentrations-als auch zeitabhängig. Eine Konzentration von 10-5 mol/l erbrachte eine 2,1-fache Erhöhung in Bezug auf TF Protein und einen 1,6-fachen Anstieg der TF Oberflächenaktivität. Die Prästimulation für 1h ergab im Vergleich zu einer Vorbehandlung für 25 h keinen wesentlichen Unterschied. Anhand RT-PCR konnte gezeigt werden, dass Paclitaxel die durch Thrombin induzierte TF mRNA Expression ebenfalls erhöht. Darüber hinaus potenzierte Paclitaxel die Aktivierung der c-Jun terminalen NH2 Kinase (JNK) durch Thrombin, wohingegen die durch Thrombin vermittelte Phosphorilierung von p38 und der extrazellulären signal-regulierten Kinase (ERK) unter Zugabe von Paclitaxel unverändert blieb. Docetaxol steigerte, ähnlich dem Paclitaxel, sowohl TF Expression als auch JNK Aktivierung im Vergleich zur alleinigen Applikation von Thrombin. Der JNK Inhibitor SP600125 konnte die Thrombin-induzierte TF Expression um 35 % reduzieren. Im weiteren wurde durch SP600125 der Effekt von sowohl Paclitaxel als auch Docetaxel bezüglich TF Expression verschleiert. Schwerpunkt des zweiten Teils der Arbeit war die Untersuchung von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) als potentielle neue Substanz zur coating von Stents. DMSO wird zur Konservierung von hämapoetischen Stammzellen verwendet und Patienten vor Knochenmarktransplantation infundiert. Trotz seiner intravenösen Anwendung wurde die Auswirkung von DMSO auf vaskuläre Zellen noch nicht untersucht. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass DMSO die TF Expression in menschlichen Endothelzellen, Monozyten und VSMC unterdrückt. RT-PCR zeigte die Inhibition die TF Expression auf mRNA Ebene, was durch die reduzierte Aktivierung der MAP Kinasen JNK und p38, jedoch nicht ERK, vermittelt wurde. In vivo unterdrückt DMSO die TF Aktivität und verhinderte im Maus-Modell einen thrombotischen Verschluss. Darüber hinaus inhibierte DMSO konzentrationsabhängig die Proliferation und Migration von glatten Gefässmuskelzellen, vielmehr verhinderte es die Rapamycin bzw. Paclitaxel induzierte Hochregulation der TF Expression. Da DMSO auf unterschiedlichem Gebiet der modernen Medizin bereits etabliert zur Anwendung kommt, empfehlen wir diese Substanz als neuwertiges Verfahren zur Behandlung eines Akutem Koronarsyndrom; im speziellen, DMSO scheint ein attraktives Mittel zur Beschichtung von Drug-eluting Stents zu sein, entweder allein oder in Kombination mit Rapamycin oder Paclitaxel.
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Medicine
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