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Texte intégral
Doctoral thesis

Eukaryotic sterol homeostasis : steryl ester hydrolases in "Saccharomyces cerevisiae"

    29.09.2006

III, 130 p

Thèse de doctorat: Université de Fribourg, 2006

English German Sterol homeostasis in eukaryotic cells relies on the reciprocal interconversion of free sterols and steryl esters (STE). The formation of STE is well characterized, but the mechanisms that control steryl ester mobilization upon cellular demand are less well understood. STE constitute an important storage form for fatty acids and sterols that are deposited in intracellular lipid particles. To identify genes that are required for the mobilization of STE, we performed an in silico analysis of the yeast genome to identify putative STE hydrolase encoding genes. This candidate gene approach revealed eight putative lipase encoding genes. To test whether one or more of these putative lipases are required for STE hydrolysis we developed in vivo assays to monitor hydrolysis of radiolabeled steryl esters in Saccharomyces cerevisiae. Upon depletion of endogenous sterol biosynthesis by terbinafine, hydrolysis of [3H]palmitic acid- or [14C]cholesterol-labeled steryl esters was monitored in cells bearing deletion of candidate hydrolase genes. This analysis revealed that the rate of STE mobilization, but not that of triacylglyerol (TAG), is strongly decreased in cells lacking YLL012/YEH1 (steryl ester hydrolase 1), YLR020/YEH2, or TGL1. These lipases are paralogues of the mammalian acid lipase family, which is composed of the lysosomal acid lipase, the gastric lipase, and four novel as yet uncharacterized human open reading frames. Lipase single mutants mobilize STE to various degrees, indicating partial functional redundancy of the three gene products. A triple yeh1Δ yeh2Δ tgl1Δ mutant shows no STE mobilization, indicating that these three genes together encode for all the STE hydrolyase activity present in yeast. STE hydrolase activity of the three lipases was confirmed by in vitro assays with radiolabeled cholesteryl ester as substrate. Functional GFP-tagged Yeh1p and Tgl1p co-localize with Erg6p, a marker protein for lipid particles, and are enriched in isolated lipid particles. Interestingly, the third lipase, Yeh2p, is localized to the cell periphery and is absent from lipid particles. YEH1, YEH2, and TGL1 encode predicted membrane proteins and were shown to be solubilized by detergent treatment only, indicating that they indeed behave as integral membrane proteins. This makes them the first membrane-anchored lipases described so far. Proteinase protection experiments, using GFP-tagged lipases, enabled us to also determine their membrane topology. The mechanisms that control STE mobilization are not well understood. The mammalian hormone sensitive lipase (HSL) has been shown to be phosphorylated upon lipolytic stimulation, which resulted in a 100-fold increase of its activity. Detailed analysis of the three STE hydrolases revealed that Yeh2p, but not Yeh1p or Tgl1p, is modified by phosphorylation and this phosphorylation depends on the growth phase of the cell. A deletion mutant screen for protein kinases that are required for phosphorylation of Yeh2p revealed that every one of the four protein kinases, SWE1, VHS1, KCC4, and YNR047 is required for phosphorylation of Yeh2p. The biological significance of this posttranslational modification, however, is not yet known. Yeast is a facultative anaerobic organism that becomes auxotrophic for sterols and unsaturated fatty acids in the absence of oxygen. It is also reported here that Yeh1p is the only active STE hydrolase in heme-deficient conditions. The steady-state levels of Yeh1p are significantly increased in heme-deficient cells, which is in line with the observation that Yeh1p is important for STE mobilization under these conditions. Taken together, the work presented here describes a novel class of membrane-anchored lipases required for STE mobilization in yeast. These lipases differ in their subcellular localization and membrane topology. Future studies based on the data acquired here will allow providing detailed insight into regulation of the three lipases and also help to clarify the physiological importance of STE in yeast. The question how STE storage and mobilization is regulated in humans is important for the understanding of an increasing number of human disorders in lipid metabolism, such as atherosclerosis, obesity and type 2 diabetes. The three STE hydrolases described in this work are paralogues of the mammalian acid lipase family and yeast will thus provide an excellent model organism to address the question how STE mobilization is regulated which in turn should be valuable for the understanding of basic principles of STE homeostasis in mammals. Sterol-Homeostase in Eukaryonten beruht auf der reziproken Umwandlung von freien Sterolen und Sterol-Estern (STE). Die Mechanismen des Aufbaus von STE sind bekannt, diejenigen der Mobilisierung von STE sind jedoch noch weitgehend unbekannt. STE stellen eine wichtige Speicherform für Fettsäuren und Sterole dar und werden intrazellulär in Lipidpartikeln gespeichert. Um die Enzyme, welche für die Mobilisierung von STE notwendig sind, zu identifizieren, führten wir eine in silico-Analyse des Hefegenoms zur Auffindung von für STE-Hydrolasen kodierenden Genen durch. Die Genomanalyse zeigte acht potentielle STE-Hydrolase kodierende Gene. Um zu testen, ob eine oder mehrere dieser Lipasen für die Mobilisierung von STE notwendig sind, entwickelten wir einen in vivo-Assay, mit welchem wir die Hydrolyse von radioaktiv markierten STE in Saccharomyces cerevisiae beobachten konnten. In Mutanten, welche für Lipase-Kandidaten Gene deletiert waren, wurde durch Blockierung der endogenen Sterol-Biosynthese mit Terbinafine die STE Mobilisierung initiiert. Dies ermöglichte uns die Rate der Hydrolyse von [3H]Palmitinsäure oder [14C]Cholesterol-markierten STE in diesen Mutanten zu bestimmen. Diese Experimente zeigten, dass die Rate der STE-Mobilisierung in Zellen, die für YLL012/YEH1 (Steryl-Ester- Hydrolase 1), YLR020/YEH2 oder TGL1 deletiert waren, sehr gering war. Dies traf jedoch nicht auf die Hydrolyse von Triacylglycerol (TAG) zu. Diese drei Lipasen sind Paraloge der menschlichen sauren Lipasefamilie, welche aus der lysosomalen sauren Lipase, der gastrischen Lipase und vier neuen, bisher nicht charakterisierten menschlichen ORFs besteht. Lipasemutanten mobilisieren STE in verschiedenem Ausmaß, was durch eine teilweise funktionelle Überlappung der Aktivität der drei Genprodukte bedingt ist. Eine yeh1Δ yeh2Δ tgl1Δ-Triple-Mutante hingegen zeigt keine STE-Mobilisierung mehr, was darauf schließen lässt, dass die drei Genprodukte zusammen für sämtliche STE-Hydrolase-Aktivitäten in Hefe verantwortlich sind. Die STE-Hydrolase-Aktivität der drei Lipasen wurde durch in vitro- Assays, in denen radioaktiv markierte Cholesteryl-Ester als Substrat verwendet wurden, bestätigt. Funktionelle GFP-markierte STE-Hydrolasen Yeh1p und Tgl1p kolokalisieren mit Erg6p, einem Markerprotein für Lipidpartikel, und sind in isolierten Lipidpartikeln angereichert. Interessanterweise lokalisiert die dritte Lipase, Yeh2p, an der Zellperipherie und kann nicht in Lipidpartikeln gefunden werden. Laut Sequenzanalysen kodieren YEH1, YEH2 und TGL1 für Membranproteine. Die drei Lipasen können nur in Gegenwart von Detergenz solubilisiert werden, was darauf schließen lässt, dass sie sich tatsächlich wie integrale Membranproteine verhalten. Dadurch sind diese die ersten Membran-verankerten Lipasen, die bisher beschrieben wurden. Proteinase-Verdau-Experimente, in denen GFP-markierte Lipasen benutzt wurden, ließen uns auch die Membrantopologie der drei Lipasen feststellen. Die Mechanismen, welche die STE-Mobilisierung kontrollieren, sind noch weitgehend unbekannt. Beispielweise wird die menschliche hormonsensitive Lipase (HSL) nach lipolytischer Stimulation phosphoriliert, was in einer hundertfachen Aktivitätssteigerung resultiert. Eine detaillierte Analyse der drei STE-Hydrolasen zeigte, dass zwar Yeh2p durch Phosphorilierung modifiziert wird, nicht aber Yeh1p oder Tgl1p. Diese Phosphorilierung hängt von der Wachstumsphase der Zelle ab. Ein Mutantenscreen nach Proteinkinasen, welche für die Phosphorilierung von Yeh2p nötig sind, zeigte, dass jede der vier Proteinkinasen, SWE1, VHS1, KCC4 und YNR047 für die Phosphorilierung von Yeh2p notwendig ist. Die biologische Signifikanz dieser posttranslationalen Modifikation ist bisher noch nicht bekannt. Die Hefe ist ein fakultativ anaerober Organismus, der in Abwesenheit von Sauerstoff auxotroph für Sterole und ungesättigte Fettsäuren wird. Es wird in dieser Arbeit auch gezeigt, dass Yeh1p die einzige aktive STE-Hydrolase unter Häm-depletierten Konditionen ist. Die “steady-state-levels“ von Yeh1p sind in Häm-depletierten Zellen signifikant erhöht, was mit der Beobachtung kongruiert, dass Yeh1p wichtig für STEMobilisierung unter diesen Bedingungen ist. Zusammengefasst bedeutet dies, dass die hier präsentierte Arbeit eine neue Klasse von Membran-verankerten Lipasen, die für die Mobilisierung von STE in Hefe notwendig sind, beschreibt. Diese Lipasen unterscheiden sich in ihrer subzellulären Lokalisation und der Membrantopologie. Zukünftige Studien, die sich auf das hier erarbeitete Material stützen, könnten detaillierte Einblicke in die Regulation der drei Hefelipasen geben und dazu beitragen, die physiologischen Aspekte von STE in Hefe zu klären. Da man erst beginnt, die regulatorischen Aspekte von STE-Lagerung und -Mobilisierung im Menschen zu verstehen, besteht ein großes Interesse an der Regulierung und vor allem an den Konsequenzen von Defekten im Neutral-Lipid-Metabolismus. Heutzutage steigt die Anzahl schwerer Krankheiten, verursacht durch Lipid-Akkumulation, wie z.B. Arteriosklerose, Adipositas und Typ-2-Diabetes, stetig an. Die drei neu entdeckten und hier beschriebenen STE-Hydrolasen sind Paraloge der menschlichen sauren Lipasefamilie. Somit stellt die Hefe einen exzellenten Modellorganismus dar, der wichtige Fragen betreffend die Regulation von STE-Mobilisierung klären kann. Die Ergebnisse sollten zu einem besseren Verständnis der grundsätzlichen Mechanismen der Cholesterol-Homeostase in Menschen führen.
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Faculté des sciences et de médecine
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Biological sciences
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