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Texte intégral
Doctoral thesis

Tenascin-R and perineuronal nets of extracellular matrix

    24.06.2000

143 p

Thèse de doctorat: Université de Fribourg, 2000

English French Tenascin-R (TN-R) is a glycosylated brain extracellular matrix protein (BECM; Zamze et al., 1999) restricted to the central nervous system (Pesheva et al., 1989; Rathjen et al., 1991; Weber et al., 1999). A special feature of TN-R, and some of its known ligands, is their accumulation around certain sub-populations of neurones, forming perineuronal nets of extracellular matrix (PNEMs; Wintergerst et al., 1996; Matsui et al., 1998; Hagihara et al., 1999; Haunso et al., 1999). In these studies, bacterial expression of the C-terminal domain of TN-R, the FG-knob, led to the formation of inclusion bodies concurring those of previous studies (Norenberg et al., 1995; Elefteriou et al., 1999). Heterologous expression of the FG-knob, as a secreted protein, in the yeast P. pastoris gave rise to different glycosylated proteins. The majority of these expressed proteins remained within the yeast cells, with only extremely low amounts being secreted. Expression of recombinant FG-knob, as a secreted protein, in a mammalian cell line (Cos-1/M6) produced two different glycosylated forms with a size difference of 40 kDa. However, these forms were not detected in conditioned medium as the FG-knob precipitated around the host cells upon secretion leading to the formation of large cell aggregates. Despite the general insolubility of the FG-knob, an affinity column was generated and potential ligands purified from pig cortex. These ligands contained neither sites to common matrix components such as elastin, collagen type II and IV or hyaluronic acid nor did they contain the carbohydrate N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc), a common constituent of proteoglycans such as chondroitin sulphates and keratan sulphates, found extensively in extracellular matrices (Lodish et al., 1995). PNEMs are lattice-like accumulations of BECM components, consisting mainly of chondroitin sulphate proteoglycans (CSPGs; Margolis and Margolis, 1993; Ruoslahti, 1996), around GABAergic interneurones expressing the calcium binding protein parvalbumin (PV). Here, it is shown that phosphacan, a specific member of the CSPG family (Matsui et al., 1998; Hagihara et al., 1999), preferentially associates with both cortical and non-cortical PNEMs. In this study, the identification of phosphacan in PNEMs in vivo provides functional and biological importance to previously described interactions with other defined PNEM components in vitro (Milev et al., 1997, 1998; Xiao et al., 1997). Recently, it has been shown in vitro that all lecticans, a family of CSPGs which form large aggregates with hyaluronic acid, interact with TN-R (Aspberg et al., 1997). Examination of PV and TN-R single and double knockout (KO) mice revealed that PNEMs appear normal in mice lacking PV whereas TN-R deficient mice show morphological alterations in these entities. These alterations have been shown to occur because defined lecticans such as phosphacan and neurocan were no longer present in PNEMs. Neither the membrane-related cytoskeleton in PV-expressing GABAergic interneurones, nor the density or distribution of cortical GABAergic interneurones were altered in any of the examined KO mice. Thus, the principal role for TN-R in PNEMs may be to attract and/or retain other matrix components. TN-R is however not envisaged to be involved in determining which neurones form PNEMs or the GABAergic properties of these neurones. The intimate involvement of TN-R in the formation of the lattice-like structure of PNEMs is probably effectuated via the multimerisation of TN-R molecules leading to the formation of a scaffold onto which other PNEM components assemble. La tenascine-R (TN-R) est une glycoprotéine de la matrice extracellulaire du cerveau (Zamze et al., 1999) dont la distribution est restreinte au système nerveux central. (Pesheva et al., 1989; Rathjen et al., 1991; Weber et al., 1999) Une des caractéristiques de la TN-R et de quelques-uns de ses ligands connus, est son accumulation autour de certaines sous-population de neurones, formant ainsi les réseaux périneuraux de la matrice extracellulaire (PNEMs; Hagihara et al., 1999; Haunso et al., 1999; Matsui et al., 1998; Wintergerst et al., 1996). Dans ces études, l'expression bactérienne du domaine COOH-terminal de la TN-R, le bouton Fibrinogène (FG), conduit à la formation de corps d'inclusion en accord avec la littérature. (Norenberg et al., 1995; Elefteriou et al., 1999). L'expression hétérologue du bouton FG sous forme de protéine sécrétée par la souche de levure P. Pastoris, a donné différentes protéines glycosylées. La majorité de ces protéines recombinantes se trouvent à l'intérieure des levures et seule une infime quantité est sécrétée. L'expression du bouton FG dans une lignée de cellules de mammifère (Cos-1/M6) sous forme de protéine sécrétée a produit deux formes de protéines glycosylées avec une différence de 40 kDa entre elles. Cependant ces deux formes n'ont pas pu être détectées dans le milieu conditionné car le polypeptide recombinant précipitait autour des cellules hôtes lors de la sécrétion conduisant à la formation de larges agrégats cellulaires. Malgré l'insolubilité générale du bouton FG, une colonne d'affinité a été faite pour tenter de purifier des ligands à partir du cortex cérébral de cerveaux de porcs. Ces ligands ne contiennent pas de sites communs aux composants de la matrice extracellulaire tels que l'élastine, le collagène type II et IV ou l'acide hyaluronique. Ils ne contiennent pas non plus d'hydrates de carbone tel que du N-acétyl-D-galactosamine (GalNAc), un constituant commun aux protéoglycans comme la chodroïtine sulfate et les kératanes sulfate que l'on trouve en grande quantité dans les matrices extracellulaires. (Lodish et al., 1995). Les PNEMs sont des accumulations en forme de treillis de composants de la matrice extracellulaire du cerveau. Ils sont constitués principalement de protéoglycans-chondroïtine sulfate (CSPGs; Margolis et Margolis et al., 1993; Ruoslahti, 1996). Ils sont localisés autour des interneurones GABAergiques exprimant une protéine liant le calcium: la parvalbumine. Dans ce travail, nous montrons que le phosphacan, un membre spécifique de la famille des CSPG (Hagihara et al., 1999; Matsui et al., 1998), s'associe de préférence avec les PNEMs corticaux et noncorticaux. Par l'identification des phosphacans dans les PNEMs in vivo, nous montrons qu'ils ont une importance fonctionnelle et biologique dans les interactions précédemment décrite in vitro avec d'autres composants du PNEM (Milev et al., 1997; Xiao et al., 1997). Il a été récemment montré in vitro que tous les lecticans, une famille de CSPGs formant de larges agrégats avec l'acide hyaluronique, agissent avec la TN-R. L'étude des souris déficientes pour les gènes de la PV et/ou de la TN-R a révélé que les PNEMs apparaissaient normaux dans le cerveau des souris déficientes pour le gène de la PV alors que dans le cerveau de celles dont le gène de la TN-R avait été supprimé, les PNEMs montraient des altérations morphologiques. Ces désordres des PNEMs survenaient parce que certains lecticans tels que le phosphacan et le neurocan n'étaient plus présents dans les PNEMs. Ni le cytosquelette lié à la membrane cellulaire des interneurones GABAergiques exprimant la parvalbumine ni la densité ou la distribution corticale de ces cellules n'étaient altérées dans les cerveaux des souris déficientes pour les gènes suscités. Ainsi le rôle principal de la TN-R dans les PNEMs pourrait être d'attirer et/ou de retenir d'autres composants de la matrice. Cependant, la TN-R ne semble pas être impliquée dans la détermination du type de neurones susceptible de former des PNEMs ou d'avoir des propriétés GABAergiques. L'implication intime de la TN-R dans la formation d'une structure en forme de treillis des PNEMs est probablement possible via une multimérisation des molécules de TN-R. Cette dernière conduit à la formation d'un échafaudage sur lequel viennent s'assembler les composants du PNEM.
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Faculté des sciences et de médecine
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